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细胞凋亡实验操作细则
发布时间:2021-10-21   点击次数:65次
  一、实验目的:
 
  1、掌屋凋亡细胞的形态特征
 
  2、学会用荧光探针对细胞进行双标记来检测正常活细胞、凋亡细胞和坏死细胞的方法
 
  二、实验原理
 
  细胞死亡根据其性质、起源及生物学意义区分为凋亡和坏死两种不同类型。凋亡普遍存在于生命界,在生物个体和生存中起着非常重要的作用。它是细胞在一定生理条件下一系列顺序发生事件的组合,是细胞遵循一定规律自己结束生命的自主控制过程。细胞凋亡具有可鉴别的形态学和生物化学特征。
 
  在形态上可见凋亡细胞与周围细胞脱离接触,细胞变园,细胞膜向内皱缩、胞浆浓缩、内质网扩张、细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、内质网和细胞膜进一步融合将细胞分成多个完整包裹的凋亡小体,凋亡小体最后被吞噬细胞吞噬消化。在凋亡过程中细胞内容物并不释放到细胞外,不会影响其它细胞,因而不引起炎症反应。
 
  在生物化学上,多数细胞凋亡的过程中,内源性核酸内切酶活化,活性增加。核DNA随机地在核小体的连接部位被酶切断,降解为180-200bp或它的整倍数的各种片断。如果对核DNA进行琼脂糖电泳,可显示以180-200bp为基数的DNA ladder(梯状带纹)的特征。
 
  相比之下,坏死是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡。细胞在坏死早期即丧失质膜完整性,各种细胞器膨胀,进而质膜崩说明放出其中的内容物,引起炎症反应,坏死过程中细胞核DNA虽也降解,但由于存在各种长度不等的DNA/pian断,不能形成梯状带纹,而呈弥散状。
 
  一些温和的损伤刺激及一些抗肿瘤药物可诱导细胞凋亡,通常这些因素在诱导凋亡的同时,也可产生细胞坏死,这取决于损伤的剧烈程度和细胞本身对刺激的敏感程度。
 
  三尖杉酯碱(HT)是我国自行研制的一种对急性粒细胞白血病,急性单核白血病等有良好疗效的抗肿瘤药物。研究表明HT在0.02~5μg/ml范围内作用2小时,即可诱导HL-60细胞凋亡,并表现出典型的凋亡特征。本实验用1μg/ml HT在体外诱导培养的HL-60细胞发生凋亡,同时,也有少数细胞发生坏死。用Hoechst33342和碘化丙啶(propidium iodide,PI)对细胞进行双重染色,可以区别凋亡、坏死及正常细胞。
 
  细胞膜是一选择性的生物膜,一般的生物染料如PI等不能穿过质膜。当细胞坏死时,质膜不完整,PI就进入细胞内部,它可嵌入到DNA或RNA中,使坏死细胞着色,凋亡细胞和活细胞不着色。而一些活细胞染料由于为亲脂性物质,可跨膜进入活细胞,因而可进行活细胞染色。Hoechst33342是一种活性荧光染料且毒性较弱,它是双苯并咪唑的一种衍生物。与DNA特异结合(主要结合于A-T)碱基区),显示凋亡细胞和活细胞。凡是看到有凋亡小体的细胞都是凋亡细胞。
 
  三、实验用品:
 
  1、试剂:三尖杉酯碱(HT),300μg/ml,100mmol/L Tris-HCl(pH7.5),5mol/L EDTA缓冲液、碱性裂解液:0.2mol/L NaOH, 1%SDS、醋酸钠:3mol/L KAc(pH4.8);异丙醇;70%乙醇;溴酚蓝,蔗糖指示剂。TBE电泳缓冲液,1%琼脂糖,溴乙锭。PI母液:500μg/ml;Ho33342母液:2mmol/L。
 
  2、仪器设备:荧光显微镜,电泳仪,电泳槽,微量加样器(1ml,100μl)0.5、1.5ml离心管,载玻片,盖玻片。
 
  四、实验材料:
 
  人早幼粒白血病HL-60细胞,用含10%小牛血清的RPMI1640培养基在37℃,5%CO2条件下培养。
 
  五、方法步骤:
 
  1、三尖杉酯碱诱发HL-60细胞凋亡
 
  (1)实验前约24小时,接种两瓶HL-60细胞,标记①、②,每瓶含约6ml培养液,置37℃,5%CO2培养箱培养。
 
  (2)实验前约2.5小时,当细胞密度达到70%,①号瓶加入三尖杉酯碱200μl,使终浓度为1μg/ml,②号瓶中加入同等量PBS(pH7.4)作对照。共同放入培养箱中继续培养2.5小时
 
  2、Ho33342和PI双重染色鉴别三种细胞a
 
  (1)染色:将瓶中的细胞摇匀,取200μl于1.5ml的离心管中,加入Ho33342母液2μl,PI 20μl,染色15分钟。
 
  (2)滴片:取一载玻片,用双面胶围成一小室,从离心管中各取以上染色后的细胞悬液10μl,加入小室内盖上盖玻片,荧光镜下用紫外激发光,高倍镜下观察,区别三种细胞,并注意三者比例。
 
  六、注意事项:
 
  1、诱导培养HL-60细胞时间要准确。
 
  2、荧光显微镜下观察细胞时,由于荧光易碎灭,观察时要尽量快。

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