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影响重组蛋白纯化的因素有哪些?
发布时间:2021-09-07   点击次数:24次
  随着分子生物学技术的发展,以蛋白质的结构和功能为基础来认识生命现象,已经成为当代生物医药研发的关注点之一。为了研究蛋白质,首先需要进行蛋白分离和重组蛋白纯化,来得到高度纯化并且具有生物活性的蛋白质。由于每一种蛋白的性质都有不同,所以没有一种通用的蛋白纯化方法,但是总的来说,一般影响重组蛋白纯化的因素主要有以下几种:
 
  1、蛋白的属性
 
  在进行重组蛋白纯化时,需要尽可能多的了解蛋白的属性。如蛋白的化学性质,是否容易被蛋白酶降解,是否会和一些金属离子、化学成分发生反应。蛋白的物理性质,是否对温度敏感等。还有目的蛋白表达的定位,目的蛋白表达在胞内、细胞内膜、周质空间还是胞外等。
 
  2、细胞内形成的区域与形式
 
  细胞内区域化指的是模型细胞器对细胞的分割作用。内膜系统在细胞内形成一个个彼此隔离、相互独立的功能性结构区域,称为细胞内房室化或区域化。细胞内区域化可以扩大细胞内的表面积,为提高细胞代谢功能奠定基础,还可以形成细胞内不同的特殊微环境,有效提高了细胞新陈代谢的质量和效率。细胞内区域化还形成了一个严密而完善的细胞内体系。古朵生物可提供蛋白纯化服务!
 
  3、蛋白表达系统的选择
 
  一般来说蛋白表达的量依赖于所选择的蛋白表达系统。如对宿主细胞具有毒性,需要选择抗毒性的表达系统。而且不同表达系统,如大肠杆菌表达系统、酵母表达系统、CHO细胞表达系统等和培养方法都显着影响下游的处理过程。
 
  4、菌株的背景
 
  在重组蛋白纯化的研究中,尤其是大肠杆菌表达纯化时,需要注意宿主菌的选择。多数人会直接选择自己实验室曾经用过的表达菌株,或者是载体配套的菌株,而不去追究原因,即使表达结果不佳,大多在表达条件和载体上找原因,也不会考究菌株的选择是否适合。菌株的背景很重要,如菌株内源的蛋白酶过多,可能会造成外源表达产物的不稳定,所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成为理想的起始表达菌株。在决定是否使用何种菌株时,还需要注意不同菌株有时已经携带某个质粒或者已经具有某种抗生素抗性,要注意自己的表达质粒是否能与之兼容。
 
  而且为了得到正确折叠的目的蛋白,在诱导方式的选择上,需要考虑表达菌株的一些情况。如表达菌种的生长情况,菌种是否健壮、是否是单克隆菌种、菌体的浓度是否适合诱导。生长状态不好的表达菌,一方面会造成目的蛋白的错误折叠,造成蛋白大小、形态等发生改变,另一方面会因为IPTG的加入,导致菌体死亡或者降解。
 
  5、表达蛋白的应用
 
  蛋白表达、分离、纯化可以探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理、供作结构与功能的研究和作为催化剂、营养剂等。选择表达载体时,要根据所表达蛋白的最终应用考虑。如为方便纯化,可选择融合表达;如为获得天然蛋白,可选择非融合表达。
 
  培养条件的选择也很重要,在实际的操作中,需要根据实际情况先小量摸索蛋白纯化条件,待最佳条件确定,可以按照比例放大来纯化目的蛋白。
 

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