bet28365365手机版-365娱乐登录网址

返回首页 在线留言 联系大家
bet28365365手机版 > 技术支撑 > 凝胶层析(凝胶过滤法)基本原理

技术支撑

凝胶层析(凝胶过滤法)基本原理
发布时间:2021-04-22   点击次数:217次

凝胶层析也称凝胶过滤法,是20 世纪60 年代发展起来的一种简便有 效的 生物 化学分离分析方法。这种方法的基本原理是用一般的柱层析方法使 相对分子质量不同的溶质通过具有分子筛性质的固定相(凝胶),从而使物 质分离。

用作凝胶的材料有多种,如交联葡聚糖、 琼脂糖、聚丙烯-酰胺凝胶、聚 苯乙-烯和多孔玻璃珠等。现以利用交联葡聚糖分离物质和测定相对分子质量 为例说明凝胶层析法的基本原理和应用。

交联葡聚糖(商品名Sephadex)是由细菌葡聚糖(以右旋葡萄糖为残基 的多糖)用交联剂环氧氯丙-烷交联形式的有三维空间的网状结构物。控制葡 聚糖和交联剂的配比及反应条件就可决定其交联度的大小(交联度大,“网 眼”就小),从而得到各种规格的交联葡聚糖,即不同型号的凝胶。“G”表 示交联度,G 越小,交联度越大,吸水量也就越小。

把经过充分溶胀凝胶装入层析柱中,在加入样品以后,由于交联葡聚糖 的三维空间网状结构,小分子能够进入凝胶,较大的分子则被排阻在交联网 状物之外,因此各组分在层析床中移动的速度因分子的大小而不同。相对分 子质量(Mr)大的物质只是沿着凝胶颗粒间的孔隙随溶剂流动,其流程短, 移动速度快,先流出层析床。相对分子质量小的物质可以透入凝胶颗粒,流 程长,移动速度慢,比相对分子质量大的物质迟流出层析柱。经过分部收集 流出液,相对分子质量(Mr)不同的物质便互相分离。SpladexG-10 到G -50 通常用于分离肽或脱盐。G-10 到G-50 通常用于分离肽或脱盐。G-75 到 G-200 可用于分离相对分子质量大于10000 的蛋白质。

交联葡聚糖分子含有大量的羟基,极性很强,易吸水,所以使用前必须 用水充分溶胀。1g 干重凝胶充分溶胀时所需的水量(mL)称为凝胶的得水 值(Wr)。因为得水值不易测定,故常用溶胀度即床体积来表示凝胶的得水 性,其定义是每克干重凝胶颗粒在水中充分溶胀后所具有的凝胶总体积。 2、凝胶柱的总体积(总床体积)Vt 是干胶体积Vg,在凝胶颗粒内部的 水的体积Vi 及凝胶颗粒外部的水的体积Vo 之和。

Vt 也可从柱的直径及高度计算。

Vo 也称外水体积。常常用洗脱一个已知完全被排阻的物质(如蓝葡聚糖 2000)的方法来测定,此时其洗脱体积就等于Vo。

Vi 称为内部体积或内水体积,可以从凝胶干重(mg)和得水值Wr 计算: Vi = mg. Wr

Vi 也可以从洗脱一个小于凝胶工作范围下限的小分子化合物,如铬-酸钾 来测定,其洗脱体积等于Vi+Vo。

某一物质的洗脱体积Ve 为:Ve=Vo + KdVi

Kd 为溶质在流动相和固定相之间的分配比例(分配系数),每一溶质都 有特定的Kd 值,它与层析柱的几何形状无关。

如果分子完全被排阻,则Kd=0,Ve=Vo。如果分子可以完全进入凝胶,那 么Kd=1,Ve=Vo+Vi。在通常的工作范围内Kd 是一个常数(0

溶质的洗脱特征的有关参数(Ve/Vo,Ve/Vt,Kd,Kav)都与溶质相对分 子质量(Mr)对数成线性关系,先洗脱几个已知相对分子质量(Mr)的球 蛋白,用Ve/Vo 对logMr 对作图,然后在同样条件下洗脱未知样品,从其 Ve/Vo 值,在图上即可找出相对应的logMr,从而进一步算出其相对分子质 量(Mr)。

不同规格的凝胶都有一定的工作范围。一般说,在工作范围之内所得的 曲线是线性的,超出工作范围曲线就不成线性。

分享到:

返回列表 | 返回顶部
上一篇 : 教您几个小贴士让您更好地使用ELISA试剂盒    下一篇 :  常见测定蛋白浓度的三种方法先容
bet28365365手机版 企业概况 365娱乐登录网址 招聘中心 技术支撑 企业动态 联系大家 管理登陆
上海古朵生物科技有限企业版权所有 主营:优质胎牛血清,EA36染色液配制,迪夫快速染色液
谷歌Sitemap
在线客服

bet28365365手机版|365娱乐登录网址

XML 地图 | Sitemap 地图