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细胞培养条件对蛋白质糖基化的影响
发布时间:2021-04-19   点击次数:111次

糖基化可能会影响蛋白质的半衰期、免疫原性、结合活性和稳定性。蛋白糖基化是一个复杂的过程,包括碳水化合物部分的连接,以及可能通过蛋白质结构中的天冬酰胺(N-连接)或丝氨酸/苏氨酸(O-连接)氨基酸连接的位置。在哺乳动物细胞培养过程中,使用不同的细胞系培养可能会在可能发生的糖基化类型上产生重大差异。糖基化的这些差异可能会对所产生的治疗性蛋白质的质量产生重大影响,细胞克隆的选择、所用的基础培养基和补料培养基也会对糖基化产生影响。

蛋白质药物在生产中使用的宿主细胞的选择和生物反应器条件会显着影响蛋白质产品的质量。这既是由蛋白质本身结构的复杂性决定,也是由在细胞培养过程中可能发生的特异性翻译后修饰所决定的,其中糖基化对药物的质量特别重要。

蛋白质和细胞培养对蛋白质质量的影响

生物药物是具有聚合物结构的蛋白质,其结构是从氨基酸序列(称为一级结构)开始,通过将氨基酸链折叠成局部,二级结构和三级构象。多链蛋白,例如IgG抗体,还具有由亚基之间的结构产生的四级结构。

用于重组蛋白质生产的宿主细胞系的选择首先取决于蛋白质的分子特性。某些细菌可用于生产简单的蛋白质,即仅由氨基酸聚合物组成的蛋白质,没有诸如糖基化的翻译后修饰(Post-translational modification,PTM),因为大多数细菌菌均无法进行糖基化。使用简单的培养基即可快速进行生产;但是,在纯化工艺上可能具有挑战性。使用酵母可以快速产生具有原始糖基化的蛋白质。通常与杆状病毒载体一起以瞬时表达的方式,昆虫细胞主要用于研发和基本产品。哺乳动物细胞用于生产复杂的蛋白质,例如抗体和酶,需要完整的PTM,包括有些复杂的碳水化合物。

下图1中显示IgG抗体的结构,糖基化位点和潜在的变异性。与小分子药物相比,蛋白质是易碎分子,面临多重稳定性挑战。典型的糖蛋白(例如IgG抗体)在其结构内具有许多可变位点,包含了四条链,总分子量为150000 Da。另外,可能发生蛋白质链的几种翻译后修饰,例如特定氨基酸的氧化和脱酰胺。每条重链还可以发生糖基化位点。

 

图1:显示IgG抗体结构,糖基化位点和潜在变异性示意图。

为什么糖基化很重要?

许多复杂的蛋白质,例如抗体和酶,都是糖蛋白,含有2–30%的碳水化合物。糖基化是一个复杂的过程,碳水化合物通过天冬酰胺(N-连接)或丝氨酸/苏氨酸(O-连接)氨基酸附着到蛋白质上。蛋白中可能含有多种糖类型,每种糖都有多个附着位点,生产中使用的哺乳动物细胞变异会导致细微的糖基化差异。

细胞克隆的选择会影响产品质量。每个克隆的糖基化和PTM能力略有不同,并且活力各不相同,从而导致释放到培养基中的细胞内降解酶的差异。因此,可能有必要选择的细胞株不是蕞高表达量的细胞克隆,而是可以实现所需的蛋白质质量的细胞株。

细胞培养条件的影响

影响糖基化类型和程度的细胞培养参数包括pH、CO2含量、溶氧量(dO2)、温度、 营养素水平和种类、聚糖前体的存在和类型、细胞存活力,因为垂死的细胞释放降解酶、和工艺过程控制水平。

与摇瓶相比,生物反应器可提供对pH和溶解气体的更大控制,因此可实现更好的过程控制,但摇瓶更经济,可轻松使用更大数量或更大的规模。因此,摇瓶通常用于培养基和补料条件的早期筛选研究。通过与生物反应器合作,通过选择基础培养基和培养补料以及添加这些补料的时间来提高生长和生产力,从而实现蕞佳的细胞培养;还可以通过优化生物反应器的充氧条件,例如CO2水平、pH、搅拌、温度、接种密度和分配比;通过使用温度变化来延长细胞培养的生产阶段的活率;并蕞大程度地减少诸如氨等抑制生长的代谢物的积累。

蕞近,微型生物反应器的可用性提供了进行多参数研究的有效途径。因此,可以进行“实验设计”(DoE)研究的方法,在该方法中可以同时评估多个相互反应的生物反应器条件。此类研究要求使用自动化的大量生物反应器以使该过程可行。

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